Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Puglia e Basilicata

ANTRACE

Con D.M. dell’8 Maggio 2002, pubblicato su G.U. – serie Generale- n.118 del 22.05.2002, l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata è stato nominato “ Centro di referenza Italiano per l’Antrace”.

Questa qualifica è il degno riconoscimento del Ministero della Salute all'impegno scientifico profuso dall'Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata e dalla veterinaria italiana nella ricerca sul Carbonchio ematico.

Salito recentemente agli onori della cronaca e della notorietà in quanto laboratorio di referenza per il test di rilevamento delle spore di Antrace sui campioni sospetti nell'ambito dell'emergenza bioterrorismo, l'Istituto foggiano ha dalla sua una esperienza pluridecennale in questo settore.

Fondamentale è stato il ruolo dell'organo politico-amministrativo che in tempi non sospetti ha investito notevoli risorse nella formazione dei propri ricercatori oltre che nella costruzione di un laboratorio di massima sicurezza che oggi rappresenta un vanto per il nostro Paese.

Il nostro impegno è quello di guardare sempre al futuro, consci dell’importante ruolo che il Paese ci ha affidato….

Presidente dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata

Il carbonchio ematico o Antrace riveste un ruolo preponderante nella storia della microbiologia medica. In effetti l’osservazione di corpi batterici nel sangue di animali infetti e il loro isolamento in purezza nei terreni colturali, permise a Louis Pasteur di dimostrare il ruolo di quelle cellule nell’infezione carbonchiosa e allo stesso tempo di elaborare la teoria che fossero i batteri ad essere la causa di molte malattie.

Gli studi sul carbonchio effettuati da Pasteur si concretizzarono nello sviluppo del primo vaccino vivo attenuato, ottenuto a seguito della crescita del batterio a temperatura di 42°C. Questa esperienza (Poully-le-Fort) viene simbolicamente fatta coincidere con l’inizio dell’era dei vaccini.

Al giorno d’oggi il carbonchio non ha più la stessa diffusione che aveva nei secoli passati, ma rimane comunque una reale minaccia economica e di salute pubblica ed è importante che le autorità sanitarie e gli addetti del settore mantengano alta l’attenzione nei confronti di questa temibile zoonosi il cui agente eziologico, a causa del largo spettro d’ospite e della elevata resistenza, risulta particolarmente incline ad un potenziale impiego nelle guerre batteriologiche e nel cosiddetto terrorismo biologico.

(Direttore dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata)

Impegno dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata nella lotta al Carbonchio ematico

Un nome più di altri è legato alla storia dell’attività dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata nella lotta al carbonchio ematico ed è quello del Prof. Costantino BATTELLI. Illustre Direttore dell’Istituto Zooprofilattico tra la fine degli anni ’50 e i primi anni ’70, è stato l’artefice dell’introduzione del ceppo Carbosap e della registrazione ministeriale del Vaccino contro il Carbonchio ematico degli ovini e dei bovini. Il ceppo, fu ottenuto nei laboratori dell’Istituto Vaccinogeno di Asmara durante la seconda guerra mondiale, dal gruppo di ricerca diretto dal Prof. Cilli. Introdotto in Italia dal Prof. Battelli, è stato utilizzato fin dal 1949 nelle campagne di profilassi vaccinale contro il carbonchio ematico ed è indiscusso il suo contributo nella lotta all’eradicazione del carbonchio ematico in Italia.

L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata è uno tra i 28 laboratori mondiali e tra gli 8 europei, a produrre il vaccino contro il carbonchio ematico. Allo stato attuale è unico produttore e distributore italiano del vaccino contro il Carbonchio ematico utilizzato nelle campagne di profilassi negli ovini, nei bovini, nei caprini e negli equini. Titolare della registrazione Ministeriale per la produzione del vaccino contro il Carbonchio ematico degli ovini e dei bovini, dal 1997 l’Istituto Zooprofilattico è diventato produttore e distributore del vaccino contro il carbonchio ematico degli equini e dei caprini, su autorizzazione del Ministero della Sanità.

Data la particolare natura della malattia, il vaccino contro il Carbonchio ematico, non è venduto nelle farmacie, ma viene distribuito alle ASL e ai Servizi veterinari regionali direttamente dall’Istituto Zooprofilattico della Puglia e della Basilicata, previa autorizzazione del Ministero della Sanità e Regioni a cui vanno presentati i piani di profilassi.

Il primo laboratorio è destinato alla ricerca e sviluppo dei metodi di identificazione e di genotipizzazione di Bacillus anthracis. In esso si effettua il test di rilevamento delle spore di antrace nei campioni sospetti.

Il secondo laboratorio è destinato a Officina farmaceutica per la produzione del vaccino contro il Carbonchio ematico.

I due laboratori pur essendo ubicati nella medesima struttura sono separati e indipendenti fra loro.

Il personale accede a ciascuna area attraverso un sistema di doppie porte a pressione negativa comandate da schede magnetiche.

Il materiale viene introdotto attraverso un sistema di ingressi simili a quelli in uso per il personale.

Il personale lavora all’interno dei laboratori munito di tute, calzari e maschere. La necessità di indossare dei respiratori è data dal fatto che deve essere ridotta al minimo l’emissione di particelle corpuscolate nell’ambiente di massima sicurezza. Tutti i locali sono provvisti di sonde per il controllo del flusso di aria, dell’umidità e della temperatura. I dati sono analizzati da un computer centrale.

Attività del Cantro di Referenza Nazionale per l’Antrace ( Ce.R.N.A.)

a) Produzione del vaccino contro il Carbonchio ematico per uso veterinario
Presso il Centro di Referenza Nazionale per l’Antrace vengono allestiti ogni anno due serie di vaccino contro il Carbonchio ematico: vaccino Carbosap e vaccino tipo Pasteur1.

Il vaccino Carbosap è costituito da una sospensione di spore di Bacillus anthracis attenuato in soluzione fisiologica contenente saponina all’1%. Esso è impiegato nella profilassi contro il carbonchio ematico negli ovini e nei bovini. Il ceppo, fu ottenuto nei laboratori dell’Istituto Vaccinogeno di Asmara durante la seconda guerra mondiale, dal gruppo di ricerca diretto dal Prof. Cilli. Introdotto in Italia dal Prof. Battelli, è stato utilizzato fin dal 1949 nelle campagne di profilassi vaccinale contro il carbonchio ematico ed è indiscusso il suo contributo nella lotta all’eradicazione del carbonchio ematico in Italia.

Dal punto di vista della patogenicità residua, il ceppo vaccinale Carbosap ha un comportamento del tutto sovrapponibile ai ceppi Pasteur di 2° tipo in quanto risulta patogeno per il topino e la cavia e completamente apatogeno per il coniglio.

Le conoscenze esatte sul corredo genetico del ceppo Carbosap sono state ottenute grazie al test PCR utilizzando coppie di primers specifiche per antigene protettivo, fattore letale e fattore edemigeno ( codificatio su pXO1) e capsula (codificato su PXO2).

I risultati hanno dimostrato che il ceppo vaccinale Carbosap possiede entrambi i plasmidi, pXO1 e pXO2, e quindi oltre ad avere la capsula è in grado di produrre tutti e tre i fattori letali. La presenza di tutti i plasmidi ha rivelato la sua similarità con altri tre atipici ceppi vaccinali Pasteur (n.1, n.2-H, n.2-17JB). Quindi, sarebbe possibile ipotizzare l’esistenza di un terzo gruppo di vaccini contro l’antrace costituiti da ceppi di Bacillus anthracis pXO1+/pXO2+.

La presenza del plasmide pXO1 e quindi dei fattori tossici ad esso correlati giustifica la capacità protettiva tra l’altro già dimostrata dal ceppo vaccinale Carbosap con tests sperimentali e risultati in campo, ma la caratteristica che più lo contraddistingue dagli altri ceppi vaccinali è che nonostante abbia un pattern plasmidico identico a quello di un ceppo patogeno, dimostra un patogenicità residua veramente molto bassa, che si manifesta nel topo e nella cavia e che non è assolutamente da attribuire alla presenza di saponina, in quanto tests di patogenicità residua in questi modelli animali sono stati effettuati con spore sospese in soluzione fisiologica..

Il ceppo Carbosap è oggetto di attenzione da parte di diversi gruppi di ricerca internazionali ( soprattutto statunitensi).

Ancora oggi il vaccino Carbosap è utilizzato nella vaccinazione di bovini e ovini anche se prove sperimentali hanno dimostrato l’efficacia protettiva anche nella specie caprina e in quella equina.

Prove di efficacia del vaccino hanno evidenziato l’elevato potere protettivo che tende ad instaurarsi anche dopo un solo intervento vaccinale. Questa particolare proprietà lo rende di grande utilità nella pratica comune in quanto il suo utilizzo risulta più vantaggioso rispetto allo Sterne che necessita, al contrario, di due interventi vaccinali.

L’inoculazione va effettuata nel sottocute a livello della parte inferiore della coda.

E’ fondamentale non sottoporre a terapia antibiotica gli animali dopo l’intervento vaccinale

Vaccino Pasteur 1
Il vaccino Pasteur 1 è costituito da una sospensione di spore di Bacillus anthracis attenuato in soluzione fisiologica contenente saponina all’1%. Esso è impiegato nella profilassi contro il carbonchio ematico negli equini e nei caprini. Il vaccino era prodotto in passato dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno e dal 1997 la produzione è passata all’Istituto Foggiano. I vaccini Pasteur sono vaccini in cui l’attenuazione è dovuta essenzialmente alla perdita del plasmide pXO1. Questi vaccini furono ottenuti da Pasteur coltivando ceppi patogeni di Bacillus anthracis ad una temperatura di 42°C. Infatti, con questo trattamento Pasteur aveva determinato la scomparsa nel ceppo patogeno del plasmide pXO1 e di conseguenza di tutti i fattori tossici in esso codificati]. L’assenza del pXO1 giustifica l’attenuazione del ceppo, in quanto non si ha produzione del fattore edemigeno, del fattore letale e dell’antigene protettivo, ma allo stesso tempo pone seri dubbi sulle reali capacità protettive di questi vaccini per la mancata produzione anche del PA].

In realtà i vaccini Pasteur hanno svolto in passato un ruolo importante nella profilassi di questa patologia e pertanto le prove in campo hanno confermato il loro potere protettivo, spiegato con la teoria non provata sperimentalmente della “popolazione mista”.

Questa teoria afferma l’esistenza all’interno di una popolazione costituita per la quasi totalità da elementi caratterizzati da un corredo plasmidico di tipo pXO1-/pXO2+, di alcuni elementi caratterizzati da un corredo plasmidico di tipo pXO1+/pXO2+ a cui è demandato il compito della produzione del PA, quindi della protezione, e quello dei fattori tossici che giustificherebbero il residuo potere patogeno espresso nel topo e nella cavia].

- vaccini Pasteur di 1° tipo, patogeni per il topo e apatogeni per la cavia; essi si ottengono facendo crescere il batterio patogeno a temperature di 42°-43°C per 15-20 giorni.

- vaccini Pasteur di 2° tipo, patogeni per il topo e la cavia e apatogeni per il coniglio; essi si ottengono facendo crescere il batterio patogeno a temperature di 42°-43°C per soli 10-12 giorni.

L’inoculazione va effettuata nel sottocute a livello della parte inferiore della coda.

E’ fondamentale non sottoporre a terapia antibiotica gli animali dopo l’intervento vaccinale.

Vaccino Sterne ( di prossima introduzione)
Il vaccino che a breve verrà introdotto in Italia è il vaccino Sterne. Esso rappresenta una categoria di vaccini contro il carbonchio ematico la cui attenuazione è dovuta alla perdita del plasmide pXO2.

Si tratta di vaccini caratterizzati da elevato potere protettivo, in quanto avendo un corredo plasmidico di tipo pXO1+/pXO2-, producono tutti i fattori tossici codificati sul plasmide pXO1 (PA, EF, LF), ma sono sprovvisti di capsula. L’assenza della capsula spiega la loro bassissima patogenicità residua.

Infatti, negli animali vaccinati le spore germinano e le forme vegetative non capsulate sono neutralizzate dai fagociti in un arco di tempo tale da permettere la sintesi di una quantità di tossine sufficiente per la stimolazione dell’immunità protettiva, ma insufficiente per un’azione dannosa nei confronti dell’organismo ospite.

Questi vaccini si ottengono coltivando ceppi patogeni di Bacillus anthracis su terreni contenenti siero equino (50%) in atmosfera controllata al 30% di CO2.

Il vaccino che si ste sperimentando è costituito da una sospensione di spore in saponina allo 1%.

Esso potrà essere utilizzato indistintamente in tutte le specie animali e la posologia sarà di 1 ml a capo.

b) Mappa dei genotipi di Bacillus anthracis circolanti in Italia
Bacillus anthracis è considerato uno tra i batteri a più elevata omogeneità genetica motivata dal fatto che la capacità di sopravvivenza delle spore ha permesso a questa specie batterica di moltiplicarsi un numero di volte relativamente basso nel corso della propria evoluzione. In contrasto con la estrema natura monomorfica del genoma di Bacillus anthracis, fu osservato che nel tratto del genoma codificato vrrA esisteva una sequenza costante di 12 nucleotidi il cui numero di ripetizioni variava da ceppo a ceppo, portando alla distinzione di 5 allelli (Variable Number Tandem Repeat o VNTR) . Recentemente sono state individuati altri tratti di DNA a livello cromosomiale e plasmidico in cui brevi sequenze nucleotidiche si ripetono più volte (VNTR) creando frammenti polimorfici che possono essere estratti facilmente con una semplice PCR. A seguito di queste scoperte si è giunti allo sviluppo della Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) una tecnica attraverso la quale la tipizzazione genotipica di Bacillus anthracis avviene sulla base delle caratteristiche di 8 VNTR (6 localizzati a livello cromosomiale e 2 a livello plasmidico). Con la MLVA sono stati analizzati oltre 1200 ceppi di Bacillus anthracis provenienti da diverse parti del Mondo e, per la prima volta, è stato possibile definire 6 clusters A1, A2, A3, A4, B1, B2 e ben 89 genotipi.

Il Cemtro di Referenza Nazionale per l’Antrace in collaborazione con il Department of Pathobiological Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University di Baton Rouge, Louisiana (USA) e il Keim Genetics Laboratory, Department of Biological Sciences della Northen Arizona University, Flagstaff – Arizona (USA) ha avviato uno studio sui ceppi di Bacillus anthracis isolati in Italia. La MLVA è stata effettuata su 38 ceppi di Bacillus anthracis isolati da focolai carbonchiosi in Puglia, Basilicata e Sicilia.

Tutti i ceppi di Bacillus anthracis esaminati appartengono al Cluster A1a e sono presenti 6 genotipi: 1, 3, 4, 12, 18,19

Non è stata evidenziata correlazione tra specie animale e genotipo infettante. Il genotipo predominante risulta il genotipo 1 già descritto in Italia , mentre meno

diffusi risultano gli altri genotipi. I ceppi analizzati, anche se appartengono a genotipi diversi, sono molto simili fra loro e potrebbero essere il risultato della evoluzione di un unico ceppo caratteristico della regione. Quindi potremmo ipotizzare che tutti i focolai di carbonchio ematico in Puglia, Basilicata e Sicilia sono legati all’azione di ceppi autoctoni di Bacillus anthracis e sarebbero da escludere al momento focolai di importazione tipici invece di altre realtà zootecniche costrette ad importare grosse quantità di granaglie e foraggio da paesi a rischio. Il ceppo vaccinale Carbosap è risultato appartenere al cluster A1 genotipo 3.

In questa analisi è stata confermata la caratteristica di questo ceppo che è quella di essere apatogeno pur avendo un corredo plasmidico pXO1+/pxO2+, tipico di un ceppo patogeno.

La MLVA è una tecnica di rapida esecuzione che ci permette di analizzare ed evidenziare anche le minime differenze tra isolati. L’obiettivo del centro di referenza sull’antrace è quello di aggiornare continuamente la mappa dei genotipi italiani di Bacillus anthracis. Lo scopo, oltre a quello di favorire gli studi epidemiologici sul carbonchio, è soprattutto quello di individuare in tempi brevi l’origine dei focolai con particolare riguardo a quelli di importazione.

Allo stato attuale sono in corso di genotipizzazione ceppi che provengono dal Lazio, dalla Toscana, dal Veneto, dalla Sardegna, dalla Campania e dalla Calabria

c) Emergenza bioterrorismo: piano di identificazione di spore di Bacillus anthracis in campioni sospetti.
L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata - Centro di Referenza Italiano per l’antrace è stato individuato dal Ministero della salute come laboratorio di riferimento per il test di rilevamento delle spore di antrace in campioni sospetti nell’ambito dell’emergenza bioterrorismo.

Il sistema adottato in Italia prevede che i campioni sospetti (buste, lettere o altro materiale contenente polveri) siano sterilizzati a 121°C per 45 minuti prima di essere inviati all’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata. Questa misura è stata adottata in quanto viene ridotta al minimo la possibilità di diffusione di materiale patogeno nell’ambiente ed inoltre è garantita la sicurezza degli operatori in tutte le fasi dal trasporto alla lavorazione.

Presso il Centro di Referenza di Foggia funziona un sistema di accettazione aperto 24 ore su 24.

Il test adottato dall’Istituto Zooprofilattico di Foggia è una PCR basata sull’amplificazione di sequenze nucleotidiche specifiche per il cromosoma, il fattore letale, il fattore edemigeno, l’antigene protettivo e la capsula di Bacillus anthracis.

Ogni campione di polvere sospetta viene divisa in due aliquote di cui una lavorata tal quale mentre l’altra con l’aggiunta di una quantità nota di DNA di Bacillus anthracis.

I campioni sono sottoposti ad amplificazione del DNA utilizzando coppie di primers specifiche per il cromosoma, l’antigene protettivo, il fattore letale, il fattore edemigeno e la capsula.

Il campione viene considerato negativo quando l’aliquota tal quale risulta negativa in PCR mentre il suo corrispettivo addizionato con DNA di B. anthracis risulta positivo.

Il campione viene considerato positivo quando il campione originario risulta positivo in PCR e il suo corrispettivo addizionato con DNA di B. anthracis risulta positivo.

Campione non idoneo
Il campione viene considerato non idoneo quando il campione originario risulta negativo in PCR mentre il suo corrispettivo addizionato con DNA di B. anthracis risulta negativo.

Il campione viene considerato non idoneo quando il campione originario risulta positivo in PCR mentre il suo corrispettivo addizionato con DNA di B. anthracis risulta negativo.

In questi ultimi due casi, il campione deve essere ripreso e sottoposto ad un procedimento di purificazione e concentrazione del DNA e successivamente portato in amplificazione..

La presente tecnica è indirizzata verso un target ben preciso rappresentato dalle polveri rinvenute in buste e plichi sospetti. Non è ritenuto valido per campioni biologici o per tamponi ambientali dove, peraltro, lo stesso CDC americano consiglia l’esame colturale, quindi il trattamento del vivo.

Il contributo del lavoro dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Foggia è quello di aver messo a punto una procedura analitica in grado discernere il test negativo per assenza di DNA di Bacillus anthracis da quello negativo per presenza di sostanza che inibiscono l’amplificazione del DNA, riducendo al minimo il rischio di falsi negativi.

Attività di Ricerca del Centro di Referenza Italiano per l’Antrace
( C.R.I.A.)

Ricerca Finalizzata 1993: Studio dei fattori tossici e protettivi di Bacillus anthracis

Ricerca Corrente 1998: Vaccino contro il Carbonchio ematico: Studio dell’attività immunoprotettiva dei vaccini Pasteur di 1° e 2° tipo e del vaccino Sterne al fine di sviluppare un vaccino subunitario (antigene protettivo) apatogeno in grado di evocare una identica risposta immunitaria

Ricerca Corrente 1999: Bacillus anthracis: Caratterizzazione molecolare dei ceppi di Bacillus anthracis coinvolti in focolai di carbonchio ematico in Italia

Ricerca Corrente Anno 2000 : Nuove metodologie analitiche per la tipizzazione degli agenti patogeni. Utilizzo della Multiple Variable Locus Tandem Repeat Analysis per la tipizzazione di Bacillus anthracis. Analisi dei ceppi italiani, verifica delle loro caratteristiche e stesura di una mappa genotipica.

Ricerca Corrente Anno 2001 : La PCR come metodo di indentificazione di Bacillus anthracis. Valutazione della sensibilità su liofili di spore inattivati con diversi metodi

Ricerca Corrente Anno 2002 : Valutazione della diffusione ambientale di Bacillus anthracis in alcune aree italiane attraverso l’analisi indiretta della presenza di anticorpi in animali al pascolo

1) Chiocco D., Sobrero L. (1985). Profilassi vaccinale del carbonchio ematico Indicazioni CEE e vaccino ad uso veterinario preparato dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata. Atti S.I.S. Vet. 1985, 39: 657-659.

2) Fasanella A., Losito S., Scaltrito D., trotta T. Consenti B. (1999). La PCR come mezzo di identificazione dei fattori di virulenza di Bacillus anthracis. Dati preliminari sull’analisi del ceppo vaccinale “CARBOSAP” utilizzato nelle campagne vaccinali contro il carbonchio ematico ovino e bovino in Italia. Atti Congresso S.I.Di.L.V., Palermo 18 – 20 Novembre 1999.

3) Fasanella A., Cocker P., Smith K., Adone R., Chiocco D., Consenti B., Hugh-Jones M (2000). Uso della MLVA (Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis) per la tipizzazione di ceppi di Bacillus anthracis isolati in Puglia e Basilicata. Atti XIV Congresso Nazionale S.I.P.A.O.C., Vol.1, 111-114;

4) Fasanella A., Smith K.L., Keys C., Coker P., Keim P., Hugh-Jones M. (2001). Molecular epidemiology of Bacillus anthracis in Italy. 4th International Conference on Anthrax, 14

5) Fasanella A., Losito S., Trotta T., Adone R., Massa S., Ciuchini F., Chiocco D. (2001). Detection of anthrax vaccine virulence factors by Polymerase Chain Reaction. Vaccine, 19, 4214 – 4218.

6) Adone R., Pasquali P., La Rosa G. Marianelli C., Muscillo M., Fasanella A., Francia M and Ciuchini F. ( 2002). Sequence analysis of the genes encoding for the major virulence factors of Bacillus anthracis vaccine strain “Carbosap”. Journal of Applied Microbiology, 93, 117-121;

7) Fasanella A., Losito S., Adone R., Ciuchini F., Trotta T., Altamura S.A., Chiocco D. and Ippolito G. (2003). PCR assay to detect Bacillus anthracis spores in heat-treated specimens. Journal of Clinical Microbiology, 41, 896-899.

8) Fasanella A. (2003). The test to reveal anthrax spores in suspect specimens in Italy. Lesson of 2001 Anthrax episode – Oral special session. 5th Intenational Conference on Anthrax. March 30 – April 3, 2003, Nice ( France)

9) Fasanella A., Losito S., Trotta T., Altamura S.A., Schiavone M.A., Chiocco D., Ciuchini F. and Adone R. (2003). Use of Carbosap strain to verify the presence of substances affecting the detection of anthrax spores in suspected specimens tested by PCR assay. . 5th Intenational Conference on Anthrax. March 30 – April 3, 2003, Nice ( France)

10) Fasanella A., Schino G., Schiavone M.A. ,Losito S. and Buonavoglia C.(2003). The presence af antobodies against Bacillus anthracis toxic factors in unvaccinated pastured sheep in Italy. 5th Intenational Conference on Anthrax. March 30 – April 3, 2003, Nice ( France)

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