L'attività del Centro di Referenza Nazionale per l’Antrace ( Ce.R.N.A.) è schematizzabile nei punti A), B), C), D), di seguito riportati:
A) Produzione del vaccino contro il Carbonchio ematico per uso veterinario
Presso il Centro di Referenza Nazionale per l’Antrace fino al 2005 venivano allestiti ogni anno due serie di vaccino contro il carbonchio ematico: il vaccino Carbosap e il vaccino tipo Pasteur 1. Dal 2006, invece, viene prodotto il vaccino contro il carbonchio ematico tipo Sterne 34F2.
Di seguito le principali caratteristiche dei vaccini sopra citati:
Vaccino Carbosap
Il vaccino Carbosap è costituito da una sospensione di spore di
Bacillus anthracis attenuato in soluzione fisiologica contenente saponina all’1%. Esso era impiegato nella profilassi contro il carbonchio ematico negli ovini e nei bovini. Il ceppo, fu ottenuto nei laboratori dell’Istituto Vaccinogeno di Asmara durante la seconda guerra mondiale, dal gruppo di ricerca diretto dal Prof. Cilli. Introdotto in Italia dal Prof. Battelli, è stato utilizzato fin dal 1949 nelle campagne di profilassi vaccinale contro il carbonchio ematico ed è indiscusso il suo contributo nella lotta all’eradicazione del carbonchio ematico in Italia.
Dal punto di vista della patogenicità residua, il ceppo vaccinale Carbosap ha un comportamento del tutto sovrapponibile ai ceppi Pasteur di 2° tipo in quanto risulta patogeno per il topino e la cavia e completamente apatogeno per il coniglio.
Le conoscenze esatte sul corredo genetico del ceppo Carbosap sono state ottenute grazie al test PCR utilizzando coppie di primers specifiche per antigene protettivo, fattore letale e fattore edemigeno ( codificatio su pXO1) e capsula (codificato su PXO2).
I risultati hanno dimostrato che il ceppo vaccinale Carbosap possiede entrambi i plasmidi, pXO1 e pXO2, e quindi oltre ad avere la capsula è in grado di produrre tutti e tre i fattori letali. La presenza di tutti i plasmidi ha rivelato la sua similarità con altri tre atipici ceppi vaccinali Pasteur (n.1, n.2-H, n.2-17JB). Quindi, sarebbe possibile ipotizzare l’esistenza di un terzo gruppo di vaccini contro l’antrace costituiti da ceppi di
Bacillus anthracis pXO1+/pXO2+.
La presenza del plasmide pXO1 e quindi dei fattori tossici ad esso correlati giustifica la capacità protettiva tra l’altro già dimostrata dal ceppo vaccinale Carbosap con tests sperimentali e risultati in campo, ma la caratteristica che più lo contraddistingue dagli altri ceppi vaccinali è che nonostante abbia un pattern plasmidico identico a quello di un ceppo patogeno, dimostra un patogenicità residua veramente molto bassa, che si manifesta nel topo e nella cavia e che non è assolutamente da attribuire alla presenza di saponina, in quanto tests di patogenicità residua in questi modelli animali sono stati effettuati con spore sospese in soluzione fisiologica.
Prove di efficacia del vaccino hanno evidenziato l’elevato potere protettivo che tende ad instaurarsi anche dopo un solo intervento vaccinale. Questa particolare proprietà lo rende di grande utilità nella pratica comune in quanto il suo utilizzo risulta più vantaggioso rispetto allo Sterne che necessita, al contrario, di due interventi vaccinali.
Vaccino Pasteur 1
Il vaccino Pasteur 1 è costituito da una sospensione di spore di
Bacillus anthracis attenuato in soluzione fisiologica contenente saponina all’1%. Esso era impiegato nella profilassi contro il carbonchio ematico negli equini e nei caprini. Il vaccino era prodotto in passato dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno e dal 1997 la produzione è passata all’Istituto Foggiano. I vaccini Pasteur sono vaccini in cui l’attenuazione è dovuta essenzialmente alla perdita del plasmide pXO1. Questi vaccini furono ottenuti da Pasteur coltivando ceppi patogeni di
Bacillus anthracis ad una temperatura di 42°C. Infatti, con questo trattamento Pasteur aveva determinato la scomparsa nel ceppo patogeno del plasmide pXO1 e di conseguenza di tutti i fattori tossici in esso codificati]. L’assenza del pXO1 giustifica l’attenuazione del ceppo, in quanto non si ha produzione del fattore edemigeno, del fattore letale e dell’antigene protettivo, ma allo stesso tempo pone seri dubbi sulle reali capacità protettive di questi vaccini per la mancata produzione anche del PA.
In realtà i vaccini Pasteur hanno svolto in passato un ruolo importante nella profilassi di questa patologia e pertanto le prove in campo hanno confermato il loro potere protettivo, spiegato con la teoria non provata sperimentalmente della “popolazione mista”.
Questa teoria afferma l’esistenza all’interno di una popolazione costituita per la quasi totalità da elementi caratterizzati da un corredo plasmidico di tipo pXO1-/pXO2+, di alcuni elementi caratterizzati da un corredo plasmidico di tipo pXO1+/pXO2+ a cui è demandato il compito della produzione del PA, quindi della protezione, e quello dei fattori tossici che giustificherebbero il residuo potere patogeno espresso nel topo e nella cavia.
In base alla patogenicità residua i vaccini Pasteur vengono classificati come:
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vaccini Pasteur di 1° tipo, patogeni per il topo e apatogeni per la cavia; essi si ottengono facendo crescere il batterio patogeno a temperature di 42°-43°C per 15-20 giorni;
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vaccini Pasteur di 2° tipo, patogeni per il topo e la cavia e apatogeni per il coniglio; essi si ottengono facendo crescere il batterio patogeno a temperature di 42°-43°C per soli 10-12 giorni.
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Vaccino Sterne
E’ il vaccino attualmente in uso per la profilassi del carbonchio ematico ed è stato introdotto in Italia nel 2006. Questo vaccino è prodotto utilizzando spore di
Bacillus anthracis, ceppo Sterne 34F2, la cui attenuazione è dovuta all’assenza del plasmide pXO2 che codifica per la capsula.
Si tratta di un vaccino caratterizzato da elevato potere protettivo, in quanto avendo un corredo plasmidico di tipo pXO1+/pXO2-, produce tutti i fattori tossici codificati sul plasmide pXO1 (PA, EF, LF), ma è sprovvisto della capsula. L’assenza della capsula spiega la sua bassissima patogenicità residua.
Infatti, negli animali vaccinati le spore germinano e le forme vegetative non capsulate sono neutralizzate dai fagociti in un arco di tempo tale da permettere la sintesi di una quantità di tossine sufficiente per la stimolazione dell’immunità protettiva, ma insufficiente per un’azione dannosa nei confronti dell’organismo ospite.
Questo ceppo è stato ottenuto in passato coltivando ceppi patogeni di
Bacillus anthracis su terreni contenenti siero equino (50%) in atmosfera controllata al 30% di CO2.
Il vaccino è costituito da una sospensione di spore in saponina allo 0,1%.
Dosaggio e somministrazione
Esso viene utilizzato nelle specie ovina, bovina, equina e caprina e la posologia è di 1 ml a capo per tutte le specie in cui viene utilizzato e di 0,5 ml negli animali al di sotto dei 6 mesi di età.
L’inoculazione va effettata nel sottocute a livello della parte inferiore della coda.
Vaccinazione primaria: devono essere somministrate due dosi a distanza di tre settimane l’una dall’altra.
Vaccinazione di richiamo: nei territori dove la malattia ha carattere di sporadicità somministrare una dose annualmente. Nei territori ad alto rischio di carbonchio ematico è consigliato un richiamo semestrale.
E’ fondamentale non sottoporre a terapia antibiotica gli animali dopo l’intervento vaccinale.
B) Mappa dei genotipi di Bacillus anthracis circolanti in Italia
Il saggio per eccellenza per la genotipizzazione di
Bacillus anthracis è quello della Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA), che si basa sull’analisi di specifiche regioni genomiche note come Variable Number Tandem Repeat (VNTR). Queste regioni del DNA per la loro natura tendono a ripetersi a tandem e hanno un più alto tasso di mutazione. La frequenza di mutazione di questi marcatori in
Bacillus anthracis è paragonabile a circa 10
-5 e la loro variabilità varia a seconda del locus.
Nel corso di questi anni, grazie alla scoperta di numerose VNTRs nell’ambito del genoma di
Bacillus anthracis, la capacità discriminatoria dell’analisi MLVA è notevolmente aumentata. Una precedente analisi delle Variable Number Tandem Repeats riportata su 15 loci ed effettuata su 219 ceppi isolati nel corso dei focolai avvenuti in Italia nel corso degli anni, ha evidenziato la presenza di 30 differenti genotipi circolanti.
Da qualche anno il Centro di Referenza Nazionale per l’Antrace, utilizza l’analisi MLVA a 31 loci per la genotipizzazione dei ceppi di antrace. L’amplificazione dei 31 loci è stata effettuata utilizzando 31 coppie di primers specifici.
Sono stati analizzati 241 ceppi di isolati da focolai italiani dal 1972 al 2019. Dall’analisi MLVA a 31 VNTRs, è emerso che, ad oggi, sono 56 i genotipi di
Bacillus anthracis circolanti in Italia. I dati ottenuti attraverso MLVA a 31 loci hanno mostrato un numero crescente di genotipi, rispetto all’analisi MLVA a 15 VNTRs mediante la quale abbiamo evidenziato solo 30 genotipi. Di questi 56 genotipi, ben 54 risultano essere geneticamente molto simili fra loro, confermando l'ipotesi che essi sono quasi certamente il risultato della evoluzione da un comune ceppo ancestrale. Questo dato è anche confermato dall’analisi CanSNPs che li inserisce nel cluster filogenetico Trans-Eurasian (TEA). Il pannello dei ceppi italiani, tuttavia presenta delle anomalie rappresentate dalla presenza del GT54, isolato nel Veneto, e del GT55 isolato in Trentino e Veneto che invece sono ceppi d’importazione non presenti normalmente sul territorio italiano.
L’obiettivo del Centro di Referenza Nazionale per l’antrace è quello di aggiornare continuamente la mappa dei genotipi di
Bacillus anthracis circolanti sul territorio italiano. Lo scopo, oltre a quello di favorire gli studi epidemiologici, è soprattutto quello di individuare in tempi brevi l’origine dei focolai con particolare riguardo a quelli di importazione, e capire che origine possano avere ceppi di antrace che potrebbero essere utilizzati deliberatamente a scopo bioterroristico.
Pertanto, la genotipizzazione mediante analisi MLVA, rappresenta uno strumento molto prezioso per studiare l'epidemiologia molecolare di
Bacillus anthracis.
C) Emergenza bioterrorismo: piano di identificazione di spore di Bacillus anthracis in campioni sospetti
Il Centro di Referenza Nazionale per l’Antrace è stato individuato dal Ministero della Salute come laboratorio di riferimento per il test di rilevamento delle spore di antrace in campioni sospetti nell’ambito dell’emergenza bioterrorismo.
Il sistema adottato in Italia prevede che i campioni sospetti (buste, lettere o altro materiale contenente polveri) siano sterilizzati a 121°C per 45 minuti prima di essere inviati all’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata. Questa misura è stata adottata in quanto viene ridotta al minimo la possibilità di diffusione di materiale patogeno nell’ambiente ed inoltre è garantita la sicurezza degli operatori in tutte le fasi dal trasporto alla lavorazione.
Presso il Centro di Referenza per l’Antrace è in atto un sistema di accettazione dei campioni disponibile 24 ore su 24.
Il test adottato dal Ce.R.N.A. è una PCR basata sull’amplificazione di sequenze nucleotidiche specifiche per il cromosoma, il fattore letale, il fattore edemigeno, l’antigene protettivo e la capsula di
Bacillus anthracis.
Ogni campione di polvere sospetta viene divisa in due aliquote di cui una lavorata tal quale, mentre l’altra con l’aggiunta di una quantità nota di DNA di
Bacillus anthracis che serve a svelare eventuali inibizioni del campione da analizzare.
I campioni sono sottoposti ad amplificazione del DNA utilizzando coppie di primers specifiche per il cromosoma, l’antigene protettivo, il fattore letale, il fattore edemigeno e la capsula.
Interpretazione del risultato
Campione negativo:
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il campione viene considerato negativo quando l’aliquota tal quale risulta negativa in PCR mentre il suo corrispettivo addizionato con DNA di Bacillus anthracis risulta positivo.
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Campione positivo:
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il campione viene considerato positivo quando il campione originario risulta positivo in PCR e il suo corrispettivo addizionato con DNA di Bacillus anthracis risulta positivo.
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Campione non idoneo:
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il campione viene considerato non idoneo quando il campione originario risulta negativo in PCR mentre il suo corrispettivo addizionato con DNA di Bacillus anthracis risulta negativo.
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Nell’ultimo caso, il campione deve essere sottoposto ad un ulteriore processo di purificazione e concentrazione del DNA e successivamente sottoposto di nuovo alla PCR.
La presente tecnica è indirizzata verso un target ben preciso, rappresentato dalle polveri rinvenute in buste e plichi sospetti. Non è ritenuto valido per campioni biologici o per campioni ambientali dove, peraltro, lo stesso CDC americano consiglia l’esame colturale, quindi il trattamento del vivo.
Il contributo dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Puglia e Basilicata è stato quello di aver messo a punto una procedura analitica in grado discernere il test negativo per assenza di DNA di
Bacillus anthracis da quello negativo per presenza di sostanza che inibiscono l’amplificazione del DNA, riducendo al minimo il rischio di falsi negativi.
D) Attività di ricerca del Centro di Referenza Nazionale per l’Antrace
RICERCA CORRENTE IZSPB 1998
“Vaccino contro il Carbonchio ematico: Studio dell’attività immunoprotettiva dei vaccini Pasteur di 1° e 2° tipo e del vaccino Sterne al fine di sviluppare un vaccino subunitario (antigene protettivo) apatogeno in grado di evocare una identica risposta immunitaria”
RICERCA CORRENTE IZSPB 1999
“
Bacillus anthracis: Caratterizzazione molecolare dei ceppi di
Bacillus anthracis coinvolti in focolai di carbonchio ematico in Italia”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2000
“Nuove metodologie analitiche per la tipizzazione degli agenti patogeni. Utilizzo della Multiple Variable Locus Tandem Repeat Analysis per la tipizzazione di
Bacillus anthracis. Analisi dei ceppi italiani, verifica delle loro caratteristiche e stesura di una mappa genotipica”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2001
“La PCR come metodo di identificazione di
Bacillus anthracis. Valutazione della sensibilità su liofili di spore inattivati con diversi metodi”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2002
“Valutazione della diffusione ambientale di
Bacillus anthracis in alcune aree italiane attraverso l’analisi indiretta della presenza di anticorpi in animali al pascolo”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2003
“Verifica dell’efficacia di bioterapici antitumorali in associazione con i fattori tossici di
Bacillus anthracis”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2004
“Verifica dell’efficacia di bioterapici antitumorali in associazione con i fattori tossici di
Bacillus anthracis: fase sperimentale sul modello animale di elezione”
RICERCACORRENTE IZSPB 2005
“Formulazione, prove di efficacia e di innocuità di un vaccino contro l’antrace costituito da antigene protettivo ricombinante (rPA).
RICERCA CORRENTE IZSPB 2008
“Modello sperimentale per la valutazione di Musca Domestica come potenziale vettore di
Bacillus anthracis”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2009
“Epidemiologia molecolare dell’antrace in Italia: analisi dei Single Nucleotide Repeats (SNRs)”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2010
“Messa a punto di un test biomolecolare per l’identificazione dei principali agenti patogeni batterici a potenziale uso bioterrorismo:
Bacillus anthracis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, yersinia pestis”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2012
“Sviluppo di un vaccino contro l’antrace costituito da fattori tossici prodotti da ceppi di
Bacillus anthracis deleti del fattore Lethal Factor (LF)”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2013
“Batteri patogeni agenti di di zoonosi neglette in Italia:
Bacillus anthracis,
Francisella thularensis,
Brucella spp. Caratterizzazione proteica mediante analisi MALDI TOF”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2015
“Studio filogenetico dei ceppi di antrace isolati da focolai italiani mediante l’analisi MLVA 31 loci e Whole Genome Sequencing”
U.O. ESTERNA DELLA RICERCA CORRENTE IZSLER 2016
“Sviluppo di metodiche alternative all'utilizzo di animali nella attività di diagnostica e di controllo dei prodotti biologici negli Istituti Zooprofilattici (IIZZSS)”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2017
“Studio della suscettibilità antimicrobica
in vitro dei ceppi di
Bacillus anthracis isolati da focolai di carbonchio ematico in Italia dal 2001 al 2017, con il metodo delle microdiluizioni in brodo”
RICERCA CORRENTE IZSPB 2018
“Messa a punto di un test di neutralizzazione delle tossine di
Bacillus anthracis per la valutazione in vitro della risposta anticorpale indotta a seguito di immunizzazione con vaccino Sterne 34F2, da adottare in sostituzione al “challenge test”
U.O. ESTERNA DELLA RICERCA CORRENTE IZSLER 2018
“Messa a punto e validazione di nuovi protocolli diagnostici per la ricerca / tipizzazione di agenti zoonotici ad alta patogenicità:
Francisella tularensis,
Bacillus anthracis e
Brucella spp.”
RICERCA FINALIZZATA 1993
“Studio dei fattori tossici e protettivi di
Bacillus anthracis”
RICERCA FINALIZZATA 2003
“Verifica dell’efficacia dei fattori tossici di
Bacillus anthracis come bioterapico naturale”
RICERCA FINALIZZATA 2006
“Tecnologie innovative applicate alla diagnostica delle malattie trasmissibili degli animali” (DIAG-NOVA)
Progetto Foggia: “Sviluppo di real time PCR multiplex, per la diagnosi differenziale tra carbonchio ematico, edema maligno, carbonchio sintomatico e gastroenterotossiemie da
Clostridium”.
PROGETTO ANTRACE ISS 2007 COOPERAZIONE ITALIA - USA
“II anno Programmi di ricerca sulle malattie infettive di grande rilievo sociale e causate da agenti di possibile utilizzo come armi non convenzionali (agenti batterici)”
PROGETTO DI COOP. SCIENTIFICA E TECNOLOGICA ITALIA-USA Progetto “MIUR” 07/08
“Le tossine dell’antrace ed il loro ruolo nella patogenesi della malattia”
PROGETTO EUROPEO QUANDHIP 2012 RICERCA EUROPEA 2012
“Individuazione degli standards di sicurezza da adottare per la rilevazione di patogni a per ridurre il rischio del bioterrorismo”
PROGETTO EUROPEO 2014 AEDNet “Anthrax Environmental Decontamination Network”
PROGETTO ARIMNet 2014 “Common Mediterranean Challenges in Animal Plant Health”
INTERNATIONAL COLLABORATIONS
2007 - 2009 :
International program ISTC ( International Science & Technology Center) project KR-1101 entitled "Assessment of Mechanisms of spatial pollution of the Territory of Kyrgyzstan by anthrax agent" financed by U.S. and EU the Republic of Kyrgyzstan
2009 - 2011 :
International program ISTC ( International Science & Technology Center) project KR-1632 entitled "Assessment of Spatial techniques of Pollution Mechanisms of spatial pollution of the Territory of Kyrgyzstan by anthrax agent. Phase II " financed by U.S. and EU the Republic of Kyrgyzstan
2010 - 2015 :
Collaboration with Dairy Veterinary Foundation (CDVF), Bangladesh Agricultural University of Mymensingh and the ICDDR of Dhaka in the context of anthrax surveillance program in Bangladesh
2012: Collaboration with National Zoonoses and Food Hygiene Research Centre (NZFHRC) of Kathmandu, Nepal
2010 – 2013 :
Collaboration with Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Mu’tah University of Al-Karak and Ministry of Agriculture in Amman, Jordan about molecular characterization of the circulating
Bacillus anthracis in Jordan
2013 :
Collaboration with Faculty of Veterinary Medicine of Tirana, Albania about molecular epidemiology of the
Bacillus anthracis in Albania
2013 :
Collaboration with Department of Environmental Sciences of Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College, Louisiana, USA
2004 – 2006 :
Anthrax EuroNet – European research networking activities to develop safe products and policies to protect our citizens from the threat of Anthrax attacks and other agents of bioterrorism.
2009 - 2011 :
European Project under PHEA Agreement Number -2007204 titled "Establishment of Quality Assurances for the Detection of Highly Pathogenic Bacteria of Potential Bioterrorism Risk" EQADeBa.
2011 - 2013 :
European Project QUANDHIP Quality Assurance Exercises and Networking on the Detection of Highly Infectious Pathogens.
2014- 2017 :Anthrax Environmental Decontamination Network, Seventh frame work programme Marie Curie Action “AEDNet - Anthrax Environmental Decontamination Network”)
2015 – 2018 :
European Project EMERGE - Efficient response to highly dangerous and emerging pathogens.
2019 – 2022 :
European Joint Action SHARP - Strengthened International HeAlth Regulations and Preparedness in the EU
2018 – 2022 :
International project ERFAN with SADC countries: “Enhancing Research for Africa Network”